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合成常见问答
Q-1: 怎样对合成DNA/RNA制品进行定量? A-1: 由于核酸在260 nm附近有强吸收，因此常根据此性质，用紫外分光光度计测定核酸溶液在260 nm的吸光度值，据此对核酸进行定量，用OD值来表示。1 OD是指：置于光路长度为1 cm的比色皿中的DNA/RNA溶液，如果其在260 nm处的吸光度值为1，则称1 ml该溶液中溶解的DNA/RNA的量为1 OD。1个OD值的合成DNA/RNA的质量约为33 μg。
Q-2: 如何测定并计算OD值? A-2: 将DNA/RNA溶液进行适当稀释，使吸光度测定值与样品浓度的关系在直线范围内，再根据原溶液的总体积与稀释倍数计算该溶液的总OD值。例如，一个200 μl的DNA/RNA溶液，如果对其进行6倍稀释，测定值为1.0时，则该溶液的总OD值为：0.2 ml×6×1.0 OD/ml=1.2 OD 。
Q-3: 合成的DNA应如何保存? A-3:
1. 干燥制品很稳定，-20℃下保存2年没问题。
2. 溶解后的DNA也请保存于-20℃，最好是分份保存，避免反复冻融。
Q-4: 合成DNA溶液在室温下放置了数天，还可以使用吗? A-4: 溶液中的Oligo DNA在常温下放置3～4天应该没问题，但最好不要放置一个星期以上。其寿命与容器、溶剂的灭菌程度有关。
Q-5: 合成的RNA应如何保存? A-5:
1. 干燥制品如能存放于-80℃是最理想的，如不能请于-20℃保存，保存2年没问题。2. 溶液状态的RNA最好保存在-80℃，如无条件，请保存于-20℃。
Q-6: 合成的荧光标记探针应如何保存? A-6:
1. 荧光探针必须避光保存。2. 本公司做过几条探针的保存稳定性试验，干燥品-20℃保存2年未发现降解。作为本公司试剂盒中的组分，-20℃保存2年，探针功能正常。
Q-7: 制品溶解后发现有少许沉淀，会影响实验结果吗? A-7: 所有的制品纯化后都要进行脱盐，脱盐是使用C18柱进行的，偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果，请稍许离心后取上清使用。
Q-8: 测定了制品的OD值后发现OD260/OD280<1.8，制品质量 (纯度) 合格吗? A-8: 由于核酸在260 nm附近有强吸收，而蛋白质在280 nm附近有强吸收，从生物体内提取核酸时，常用OD260/OD280比值来评价核酸纯度 (比值在1.8～2.0之间)，这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同，序列很短 (通常在20～30个碱基之间)，其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同，由于各种碱基的摩尔消光系数不同，因此不同碱基构成的合成DNA/RNA制品的OD260/OD280比值也不同，例如当序列中C、T碱基的含量高时，该比值会大大低于1.8。此外，序列中碱基的排列顺序也影响该比值。所以不能根据OD260/OD280比值来评价合成DNA/RNA制品的纯度。
Q-9: 能否根据电泳带的亮度对合成的DNA/RNA制品进行定量?
A-9:
不能。因为EtBr是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA/RNA分子为单链，只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构，才能被EtBr染色。由于不同制品的序列不同，形成双螺旋的能力不同，因此染色能力不尽相同，也就不能根据EtBr染色带的亮度来对合成的DNA/RNA进行定量。
Q-10: 使用3%的Agarose凝胶电泳合成Oligo DNA制品，发现有很多条泳带，为什么?
A-10:
Oligo DNA的电泳一定要使用变性PAGE电泳。Oligo DNA是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带 (更无法用Agarose电泳进行定量了)。
Q-11: 进行PAGE电泳时，长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置?
A-11:
1. A、G、C、T的组份不同，电泳速度不同；
2. DNA的立体结构不同，电泳速度不同。 这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生，长链Oligo DNA之间差别较小。
Q-12: PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，为什么?
A-12:
如果测序后引物处出现了问题，不排除PCR错配的可能，但更主要的原因应在合成引物本身。在引物合成过程中，除了人为将序列输错 (可核对合成报告单)，化学合成方法本身不可避免地会产生失败序列，具体分析如下：1. 由于DNA合成是从3′ →5′ 端一个碱基一个碱基地连接上去的，每连接上一个碱基，都需要多步化学反应 (Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation)，我们称之为一个循环。Coupling是上一个碱基的5′ OH 与下一个碱基的3′ 活性部分发生偶联反应，该反应的效率最高可达99%，即便如此，仍有1%的序列不能连接下一个碱基，这些序列在经过Capping后脱离循环，成为缺碱基的失败序列；
2. Capping是将没有连接上下一个碱基的5′ -OH乙酰化，阻止其进一步延伸。Capping的效率不可能达到100%，没有被Cap的5′ OH会进一步发生反应，造成中间缺碱基的失败序列；
3. Detritylation是将上一个碱基5′ OH上的保护基脱掉，准备连接下一个新碱基，脱保护的效率也很难达到100%，没有脱保护的5′OH会跳过该循环而直接进入下一个循环，造成中间缺碱基的失败序列；
4. 在Coupling步骤中，新碱基 (活性状态) 在没有与上一个碱基发生偶联反应前发生自身连接，造成多碱基的失败序列；
5. 合成时碱基G可能会转化成烯醇式异构体，PCR扩增时被DNA聚合酶识别作A，发生 G到A的转换。上述各种原因产生的失败序列可通过纯化不同程度地得到去除。对40 mer以下的DNA制品，HPLC是最好的纯化方法，其次是PAGE；而对40 mer以上的DNA制品PAGE纯化要优于单纯的HPLC纯化。所以，如您要对PCR产物克隆后测序，一定要选择PAGE纯化或HPLC纯化的引物。
Q-13: PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，怎么办?
A-13:
1. 因为引物纯度不可能是100%，因此，挑选克隆时，有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时，请重新挑选一个克隆测序，会得到正确的结果。
2. 如果挑选2～3个克隆测序情况还没改观，我们会免费重新合成引物。
Q-14: 进行蛋白表达实验数个月不成功，后经测序发现引物处有错误，怎么办?
A-14:
1. 表达实验之前一定要对DNA序列进行验证。
2. 我们可以免费重新合成引物。
3. 如进行索赔时，按国际行业惯例，索赔范围限于制品价格范围之内。
Q-15: 怎样才能保证Oligo DNA的正确性?
A-15:
1. 合成Oligo DNA时，选用高纯度级制品。
2. 避免使用过长的Oligo DNA，最好选用小于35 mer的合成DNA制品。
3. 进行克隆实验时，每次克隆都须进行测序验证，以保证序列的正确性，然后再进行进一步实验。进行蛋白表达实验时，尤其需要注意。
Q-16: Takara可合成多长的DNA，多长的RNA?
A-16:
Takara合成DNA的长度为2～150个碱基；合成RNA的长度为2～60个碱基。当合成的DNA序列较长时，由于合成及纯化方法的限制,很难保证制品中每个序列都正确无误。此外需要说明的是：如果待合成序列比较特殊 (例如多个“G”连续出现等)，合成收率相对较低，我们可能会根据具体情况加收费用；有时我们也可能无法合成订购的序列，此时本公司保留不接受定单的权利。
Q-17: 一般的合成Oligo DNA的5' 和3' 末端有磷酸基团吗?
A-17:
没有，5' 和3' 末端均为-OH基。如需要加磷酸基团，订货时请特别注明，此时需收取磷酸化 (PO4修饰) 的费用。
Q-18: 平端的PCR产物难以克隆，为什么?
A-18:
由于一般的PCR用引物的5′ 末端都没有磷酸基团，因此，扩增后的PCR产物的5′ 末端也没有磷酸基团。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去；而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会极高。此时请对PCR产物的5′ 端进行磷酸 (PO4修饰) 化处理。
Q-19: 合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?
A-19:
PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。
1. 引物和模板是否配对，同源性有多大?
2. 引物本身是否有立体结构，或者二条引物之间是否形成高次结构?
3. PCR反应用试剂是否能正常工作?
4. PCR仪是否工作正常?
5. PCR反应条件是否合适?
如果一切正常，还无法解决问题时，我们可以免费重新合成引物。如果重新合成的引物也无法解决问题时，请把引物和模板寄送给我们公司，我们可以帮助摸索PCR反应条件。
Q-20: 进行反义核酸实验时，是否要对DNA链全部进行S代修饰，除了S代外，还有什么办法可增加核酸在生物体内的稳定性?
A-20:
DNA经S代修饰后比较稳定，在细胞中不会被核酸酶降解。如果整条链全部S代，的确能增加DNA的稳定性，但会降低其TM值，也即降低该反义DNA与靶序列的结合效率。因此，科研人员一般采用将DNA片段两端插入数个(通常3个)S代磷酯键(Phosphorothioated Bonds)，这样既能增加DNA的稳定性，又能增加反义DNA与靶序列的结合能力。不过如果要将反义DNA注入到活的动物体内，为增强稳定性，还是将整条链S代效果更好。
2' O-Me RNA也阻抗核酸酶降解，可与S代DNA构成嵌合的反义核酸，这样既能增强反义核酸的稳定性，又能增加其与靶序列的亲和性 (2' -OMe-RNA与RNA的亲和力要比DNA与RNA的亲和力大很多)。
此外，5-Me-dC由于能增强DNA双螺旋的稳定性，有时也被掺入到S代的反义核酸中。
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